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ELI-SPOT 及其应用

更新时间：2013-06-17点击次数：1841

一、            原理
ELI-SPOT，即斑点ELISA，是利用酶标板作反应容器进行的酶联免疫反应。其基本原理与ELISA相同。首先用捕获抗体包被反应板，封闭后，依次加入待检标本、生物素化检测抗体、链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶及底物，阳性结果出现斑点显色，利用倒置显微镜进行斑点计数。其优势在于可在与体内（活体条件）极接近的条件下，在体外对细胞分泌成分（如细胞因子、Fas等）进行追踪研究。
几点说明：
l        反应板：ELI-SPOT所用的反应板可以是PVDF膜包被好的，也可以是普通酶标板。如用普通酶标板，需用特制的琼脂糖底物溶液。因此，ELI-SPOT又可分为PVDF法和琼脂糖法。
l        待检标本须制成单细胞悬液，细胞经适当诱导剂刺激后产生相应的因子。
l        细胞诱导方法：细胞诱导可分为直接法和间接法。如果细胞诱导过程是在抗体包被的反应孔内进行的，即为直接法；如果细胞诱导过程是在24孔板或烧杯中进行的，即为间接法。采用直接法还是间接法取决于以下几个方面：待分析细胞的类型。‚预期的能分泌细胞因子的细胞数。如果预期的可分泌细胞因子的细胞量少，建议使用直接法；如果可分泌细胞因子的细胞量特别高，用间接法。
l        诱导剂及诱导时间的选择：与待检因子种类相关，参照下表（厂家提供，仅供参考）
待检因子
样本来源
诱导剂
诱导时间
检测用细胞量
Human IL-2
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
5x104-1x105
Human IL-4
CD4+ T细胞
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x105-2.5x105
Human IL-6
PBMC
LPS
10-15 hours
1x104-2.5x104
Human IL-10
PBMC
LPS
20-24 hours
2x105-2.5x105
Human IL-12
PBMC
LPS
Overnight
1x105-2.5x105
Human IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Human TNF-α
PBMC
LPS
10-15 hours
2x104-4x104
Human Fas L
PBMC
Anti-human CD3
（B-B11）, IL-2,
/ PMA,Ionomycin
3days,10-15 hours
3x105-4x105
Murine IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Rat IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Rat TNF-α
Rat splenocyte
LPS
10-15 hours
2x104-4x104
 
二、            ELI-SPOT 操作步骤
A：PVDF法
1． 96孔PVDF包被板经70%已醇处理后，用捕获抗体进行包被。
2． 单细胞悬液（含适当诱导剂）加入反应孔内，孵育（直接法）；如用间接法，细胞在24孔板或烧杯中诱导后，取适量诱导过的细胞悬液加入到反应孔内。
3． 倒掉细胞，加入生物素化检测抗体，孵育。
4． 加链霉菌抗生物素蛋白碱磷酶。
5． 加入BCIP/NBT底物，形成斑点。
B：琼脂糖法
1． 用捕获抗体包被酶标板。
2． 单细胞悬液（含适当诱导剂）加入反应孔内，孵育（直接法）。如用间接法，细胞在24孔板或烧杯中诱导后，取适量诱导过的细胞悬液加入到反应孔内。
3． 倒掉细胞，加入生物素化检测抗体，孵育。
4． 链霉菌抗生物素蛋白碱磷酶。
5． 加入琼脂糖底物溶液，形成斑点。
 
三、            ELI-SPOT 检测单细胞分泌细胞因子的意义
细胞因子是一类由白细胞和其它一些细胞产生的，可在细胞间进行信息传递。大多数细胞因子是生长或分化调节因子，通常在造血系统中发挥作用，同时发现其在脑、肌肉和内分泌器官间也存在相互作用，另外，还能诱导细胞凋亡。在一些疾病中，如急性炎症、血液病、癌症和自身免疫性疾病中可常见细胞因子的异常表达。
在单细胞水平进行细胞因子的监测提供了zui接近“原位”环境的，即zui接近体内条件，观察细胞因子产生的方法。这正是ELI-SPOT方法的特性。它可使科研工作者在体外进行与体内环境相似的研究。利用这一方法，可跟踪细胞因子的产生、跟踪疾病进展、调整临床治疗策略、防止病情恶化以及致命后果的发生。
 
四、            ELI-SPOT应用
1． 在自身免疫脑脊髓炎疾病研究中，给大鼠注射干扰素β后，可显著隆低可产生干扰素γ的细胞的数量。（1）
2． 进行免疫基因肽疫苗的评价。（2）
3． 接种途径效果的评估。（3）
4． 研究TH1/TH2 T细胞产生细胞因子的方式以及由一个亚群向另一个亚群转换的情况。（4，5）
5． 成功检测黑色素瘤中肿瘤活性T细胞数量。（6）
6． 用于重症肌无力患者外周血IFN-γ、IL-10分泌性T细胞的研究。（7）
 
五、            参考文献：
1． Ruuls, S.R. et al., 1996  J. Immunol. 157:5721
2． Kulane, A. et al., 1997  Acta Tropica. 68:37
3． Ibsen, M. W. et al., 1997  Scand. J. Immunol. 46:274
4． Gabrielsson, S. et al., 1997  Allergy. 52:860
5． Elaghazali, G. et al., 1997  Clin. Exp. Immunol. 109:84
6． Scheibenbogen, C. et al. 1997  Int. J. Cancer 71:932
7． 侯世芳，闫晓波，王维治，1999  第六届全国神经免疫学术研讨会论文汇编
 

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