降钙素基因相关肽对心肌细胞缺血缺氧状态下胞内钙的影响

第四军医大学学报2000年第21卷第4期

商立军　臧益民　王春梅　臧伟进　董明清　陈贤明　王四旺

　　摘　要:目的　观察降钙素基因相关肽（CGRP）对急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态 下胞内钙的影响.方法　急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下，以Fluo-3作为钙指示剂，用共聚焦显微镜测定胞内钙的变化.结果　急性缺血缺氧时，心 肌细胞胞内钙浓度降低，加入CGRP后，钙浓度恢复；先加入CGRP,再在缺血缺氧的条件下，胞内钙浓度基本保持不变.结论　CGRP可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内钙浓度降低.

　　关键词：降钙素基因相关肽；缺血；缺氧；肌细胞；胞内钙；Fluo-3

　　0　引言

　　降钙素基因相关肽（CGRP）是一种内源性生物活性多肽，对心血管系统的活动具有十分重要的调节作用，有明显的抗心律失常作用，可引起正常及缺血状态下心肌细胞离子通道的变化，但其作用机制尚有待进一步研究. 在模拟缺血缺氧状态下,我们用共聚焦显微镜结合Fluo-3染色技术,观察C gRP对急性分离心肌细胞胞内钙的影响.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　液体配置台氏液（单位为mmol·L^-1）　NaCl143, KCl 5.40, Mg Cl₂ 0.50, CaCl₂ 1.80, HEPES 5.00, NaH₂PO₄0.33, Glucose 5.50, pH值用NaOH调至7.35 . 无钙台氏液：台氏液中去除 CaCl₂即可.含酶液：无钙台氏液中加入0.1 g·L^-1胶原 酶和0.7 g·L^-1的BSA. KB液（单位为 mmol·L^-1）： l-glutamic acid 70, KCl 25, taurine 20, KH₂PO₄ 10, MgCl₂3, HEPES 10, Glu cose 10, EGTA 0.50, pH值用KOH调至7.35.模拟缺血缺氧液：台氏液中去除 Glucose,将 pH值降到6.8，且实验前用纯氮气饱和至少1 h. CGRP在实验前加入到台氏液中，zui终浓度为 1 nmol·L^-1.

　　1.1.2　豚鼠心肌细胞分离　豚鼠由本校实验动物中心提供，雌雄不拘，体质量200～250 g，10 g·L^-1戊巴比妥钠（ip40 mg·kg^-1）麻醉. 气管插管后在正压人工呼吸状态下开胸，充分暴露心脏和升主动脉，然后在原位进行主动脉插管，摘出心脏后置于Langendorff装置进行主动脉逆向灌流（灌流与插管同步进行）. 先用台氏液灌流3 min左右，复跳以充分冲洗冠脉内残血，再用无钙台氏液灌流直至心脏*停跳. 再用含有0.1 g·L^-1胶原酶（Yakult,日本）和0.7 g·L^-1 BSA（华美公司）的无钙台氏液灌注约5 min，zui后用KB液冲洗残酶 约5 min. 将心脏从Langendorff装置上取下，置于37℃ kB液中剪碎，温育，吹打5～10 m in. 经过滤后置于室温下静置1 h后进行实验. 整个灌流系统温度保持在37℃，所有液体均用纯氧饱和.

　　1.2　方法　急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下胞内钙离子的测定原理: f luo-3是一种敏感性钙指示剂，能特异性地与Ca²⁺结合，并在一定波长激发光激发后产生荧光，且与Ca²⁺结合后其荧光光谱发生变化，其荧光强度与Ca²⁺浓度成正比，因而可用于观察Ca²⁺的动态变化，但Fluo-3为极性大的酸性化合物，难以进入细胞，而当其结合上亲脂的乙酰氢甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM,再与细胞温育时，很容易透过细胞膜，胞质内的非特异性酯酶将其酯解脱去脂基生成游离的Fluo-3.

　　1.2.1　Fluo-3/AM的负载　用台氏液洗涤标本2次后，于室温避光条件下 用Fluo-3/AM（10 mg·L^-1）负载细胞约30 min. fluo-3/AM预先按1 g·L^-1溶 于DMSO配制，混匀后存于-20℃.然后将细胞滴加到特制的培养皿中，静置贴壁后再用台氏液冲洗细胞2～3次，即可在激光共聚焦显微镜下进行观察、测量.

　　1.2.2　细胞内钙的测定　将负载后的细胞放在特制的培养皿下，常温下测定所选定的 细胞内的钙值，然后依实验条件分别加入含CGRP的台氏液、缺血缺氧液或正常台氏液，时间间隔5～10 min,分别测定各时间点的钙值，动态扫描细胞内荧光强度变化.我们使用的是 Bio Rad 公司的MRC-1024 LSCM，其单幅采样频率可达4 hz，如需观察Ca²⁺的快速变化，可线扫方式，则其采样频率为488 Hz. 与Ca²⁺结合的Fluo-3可以被488 nm的氩 离子激光激发，可在525 nm处探测到荧光发射，其荧光强度的变化可指示胞内游离钙浓度的相对变化. 未经校对时虽不能得到［Ca²⁺］_i的值，但通过记录荧光强度的变化，可观察到胞内［Ca²⁺］_i的空间分布及药物等条件改变时胞内［ ca²⁺］_i的变化幅度.

　　2　结果

　　2.1　CGRP对缺血缺氧后胞内钙的影响　心肌急性缺血缺氧即刻，胞内钙降低且基本稳定,1 min后加入CGRP可见胞内钙浓度迅速升高 ，5 min后继续升高，可上升到未缺血缺氧前的水平.然后用台氏液洗脱上述作用，胞内钙又回复到缺血缺氧后的状态（Fig 1）.

　　2.2　预先加入CGRP再缺血缺氧时胞内钙的变化　先加入CGRP可略微升高胞内钙的值，但不显著且随时间的延长，5 min及10 min升高的幅度不大.此时加入缺血缺氧液，胞内钙几乎没有变化；开始时整体都略有抬高，但3 min后 即恢复，10 min后用台氏液洗脱，胞内钙值能回复到静息状态的水平（Fig2）.

图 1　缺血缺氧后加入CGRP细胞内荧光光密度曲线

　　fig 1　Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxia, and then with CGRP

图 2　预先加入CGRP再缺血缺氧时细胞内荧光光密度曲线

　　fig 2　Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxi a with added CGRP in advance

　　3　讨论

　　细胞内游离Ca²⁺在细胞信息传递过程中起着重要的作用.［Ca²⁺］ _i能反映细胞的状态、药物和环境等对细胞的影响.测量细胞内游离Ca²⁺的方法有：钙离子选择性微电极法 、放射示踪法和标记示踪法等^［1］.我们采用第三代Ca²⁺荧光指示剂Fluo-3 , 利用激光共聚焦扫描技术来 观察胞内Ca²⁺的空间和时间变化. fluo-3是*在可见光区有激发峰的荧光剂，可 以避免紫外光对细胞的损害和激发自荧光倾向，它和Ca²⁺结合后荧光强度增强40倍,故Fluo-3适用于观察Ca²⁺的空间分布和快速时间变化,是目前荧光剂中性能*，应用zui多的一种.

　　CGRP对缺血缺氧时胞内钙的影响可能是各种因素共同作用的结果：首先,细胞处于急性 缺血缺氧早期状态时，膜去极化可导致Ca²⁺内流减少，从而使胞内钙浓度降低.同时 ，缺血 时细胞内ATP水平降低，可激活I_K，ATP电流，使心肌细胞复极明显加速，从而使进入细胞内 Ca²⁺减少. 再者,CGRP 可激活Ca²⁺通道，促进L型Ca²⁺内流增加，使胞内钙浓度升高. 这可 能是因为CGRP通过作用于其特异受体，激活细胞内腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷系统，引起cA m P增加,再激活某种蛋白激酶，使钙通道蛋白磷酸化，增加钙通道的开放概率和时间的缘故.另外还有,Ca²⁺引起Ca²⁺释放（calcium-induced calcium release, CICR）的 机制等^［2-4］.我们的研究结果表明，在急性缺血缺氧时,急性分离心肌细胞胞内钙浓度降低，CGRP可引起 胞内钙浓度稍微升高，且可改变缺血缺氧引起的胞内钙浓度的降低.这种钙的变化无疑改变了细胞内环境的稳定，同时也说明胞内钙是受多种复杂因素调控的，其详细机制还需进一步实验来阐明.

　　基金项目:国家自然科学基金资助项目（39970273）

　　作者简介：商立军（1969-）, 男（汉族），河南省济源市人.讲师，博士生 （导师臧益民）. 已发表论文30篇. .（029）3374521商立军（第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西西安 710033）

　　臧益民（第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安710033）

　　董明清（第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安710033）

　　王春梅（第四军医大学基础部:中心实验室，陕西 西安 710033）

　　臧伟进（西安医科大学心血管生理药理研究室,第四军医大学）

　　陈贤明（西安医科大学西京医院耳鼻咽喉科,第四军医大学）

　　王四旺（西安医科大学心药物研究所,第四军医大学）

　　参考文献:

　　［1］ Brandes R, Figueredo vM, Camacho SA et al. Quantitation of cytosolic ［Ca²⁺］_i in whole perfused rat hearts using indo-1 fluorome try［J］, Biophys J,1993;65:1973-1979.

　　［2］ Cornfield DN, Stevens T, Mcmurtry IF et al. Hypoxia-induced i ncrease in fetal pulmonary artery smooth muscle cell ［Ca²⁺］_i is mediat ed by entry of Ca²⁺ through voltage-operated Ca²⁺ channels （A bstract）［J］. Pediatr Res, 1993;33:320-321.

　　［3］ Berridge MJ. Elementary and global aspects of calcium signalling ［J］. j Physiol, 1997;499（2）:291-306.

　　［4］ Lopez-lopez JR, Shacklock PS, Balke CW et al. Local calcium tra nsients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells［J］. Science,1995;268（5213）:1042-1045