Tumor M2-PK 丙酮酸激酶PK盒子

 

丙酮酸激酶PK是糖酵解途径的一个关键酶，目前研究表明，几乎所有不同组织来源的肿瘤均伴有丙酮酸激酶的异构重整体M2-PK的过度表达, 故称为肿瘤型M2-PK（Tumor M2-PK，Tu M2-PK）。在正常细胞中，M2-PK主要以三聚体的形式存在，而在肿瘤细胞中，M2-PK大量表达并转变为主要以二聚体的形式存在。三聚体的M2-PK与磷酸烯醇丙酮酸PEP亲和力很高，而二聚体的M2-PK与PEP的亲和力则低的多，后者因此导致磷酸烯醇类物质的堆积，这有利于肿瘤细胞进行无氧糖酵解。

Tu M2-PK的升高可见于大多数癌症患者。尽管不同组织来源的肿瘤或同种肿瘤的不同阶段，其血中M2-PK的平均水平存在着一定的差别，但作为肿瘤标志物，M2-PK是很有应用价值的。尤其是肾癌，长期以来一直未发现较特异的肿瘤标志物,M2-PK很可能成为目前*可用于临床诊断肾癌的生化指标。早在1993年，在Hamburg召开的（德国）第七界肿瘤标志物研讨会上，Tu M2-PK就作为一种新的肿瘤标志物被提了出来。不过，比较其特异性而言，Tu M2-PK的灵敏度相对偏低。所以，用于诊断和筛选肿瘤患者，Tu M2-PK还应与其他有关的肿瘤标志物联合检测，以同时提高临床诊断的特异性和灵敏度。

本试剂盒能灵敏的高特异性地检测出人体血液内的Tu M2-PK------一种可以用于癌症的筛查、诊断和跟踪治疗的新的肿瘤标记物。

本实验采用双抗体夹心法原理，抗人M2-PK单抗包被于酶标板上，标准品和EDTA血浆标本中的M2-PK就会与板上的单抗结合，被固定，通过洗板，将未结合的游离成分洗去；再加入生物素化的M2-PK的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素和亲合素特异性结合；抗人M2-PK抗体与结合在单抗上的M2-PK结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有M2-PK，辣根

 

 

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过氧化物酶会使无色的显色剂显蓝色，加终止液变黄，在450nm处测OD值，M2-PK浓度与所测OD450值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中M2-PK浓度。

包被有肿瘤M2-PK单克隆抗体的酶标板（12ⅹ8孔）

肿瘤M2-PK标准品1→4个  4×1.0 ml         质控液           1×1.0 ml

肿瘤M2-PK多抗           1×10 ml          酶联物           2×6.0 ml

浓缩洗涤液（25ⅹ）        1×20 ml          底物A           1×6.0ml

浓缩标本稀释液（10×）    1×10 ml          底物B           1×6.0ml 

终止液                    1×6.0ml

血浆抗凝剂只能使用EDTA，其他血浆均不能使用。建议1-2小时内离心，避免剧烈摇动。（2000g离心十分钟）。标本在4⁰C可以保存一天，在-20⁰C可以保存一年。标本收集后若不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融。

1．   500ml的量筒;  2 ml、5 ml、10 ml的吸管;  酶标仪（450+10nm）一台

2．   微量加样器：0-50μl，50-200μl，200-1000μl

可行的加样板设计:

S1~S42：EDTA血浆标本       Blank：吸入100微升标本洗涤液在A1和A2孔

 

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STD：    标准品             PC：  质控液

标准品：在*条和第二条孔中各加入100微升标准品，作为对照实验

1号标准品=8U/ml             2号标准品=15U/ml

3号标准品=35U/ml            4号标准品=50U/ml

1.        标准品和质控液的准备：向盛有标准品和质控液的小瓶中各加入500μl标本稀释液，并充分混匀。

2.        质控液： 20U/ml±10%  在F1和F2孔中各加100μl。

3.        标本洗涤液的准备： 20ml浓缩洗涤液（25ⅹ）+400ml蒸馏水，此份稀释液在4-8⁰C可保存六周。

4.        标本稀释液的准备： 用蒸馏水按1：10稀释，稀释后放2-8℃保存。

5.        酶标板的准备： 在打开之前把酶标板置于室温，取需要量的酶标板置于框架内，未使用的酶标板于有干燥剂的密封塑料袋中保存。

6.       EDTA血浆的稀释（1：100）: 10μl EDTA血浆+1ml标本稀释液，充分混合。

7.        按照待测标本数目取相应的酶标板条于框架上，除空白孔外，分别将标本和不同浓度的标准品、质控液（100μl/孔）加入相应孔中（做双孔），振荡均匀，于37⁰C，温育60min。

8.        取出反应的酶标板条，倒掉孔内的液体，加入标本洗涤液洗涤5次，于干净的纸上拍干，除去残留的液体，向每孔中加入M2-PK多抗100μl，振荡均匀，于37⁰C，温育30min。

9.        取出反应的酶标板条，倒掉孔内的液体，加入标本洗涤液洗涤5次，于干净的纸上拍干，除去残留的液体，向每孔中加入酶联物100μl，振荡均匀，于37⁰C，温育30min。

10.     取出反应的酶标板条，倒掉孔内的液体，加入标本洗涤液洗涤5次，于干净的纸上拍干，除去残留的液体，向每孔中加入A、B底物各50μl，振荡均匀，于37⁰C，温育10-15min。

10.  取出反应的酶标板条，立即向每孔中加入50μl终止液，于5分钟内在450 nm处用酶标仪读出吸光度。

结果判断：以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐c标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

参考浓度≤15U M2-PK/ml  EDTA 血浆，对应90%的参照组除肿瘤病还感染有其他疾病。

含量在15-20U/ml的数值为不确定的可疑血浆。

1．   所有的试剂和酶标板在使用之前均要平衡至室温。

2．   使用前应摇匀所有的液体试剂，但要防止瓶盖上沾有试剂。

3．   操作时应该按照相同的程序操作和相同的时间间隔。

4．   为了避免污染，使用干净的加样器吸管和干净的容器，不要使用同一个容器来盛装不同的试剂。

5．   每次洗涤时要倒置酶标板于干净的纸巾上拍打，除去残留液体，避免液体回溅，培养过程中的洗涤每次至少要1分钟。

6．   加试剂和样本之后应振荡酶标板以保证试剂的均匀分布，若有泡沫请用干净的针除去。

7．   实验操作过程中要注意安全，避免皮肤直接接触标准品、质控液，更不能用嘴吸液，要带手套，不同批号的材料不要混用。

8．  操作完成要按照说明妥善保管好各种试剂。

1. 本试验结果需结合临床表现、病史及其他诊断结果方可采取适当临床处理。

2. 2－8℃贮存,贮存至有效期结束；不同批号的试剂不能混用，标本稀释液及酶联物不能冻结。本试剂盒有效期九个月。