流式细胞术检测血小板功能及其临床应用?

血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。这就要求建立一种灵敏、、快速、简便，可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
 　　由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表达［2］。该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。
　　一、全血法流式细胞术
　　1.方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。
　　传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。为此，Shatti等［2］引入了全血法流式细胞术。该技术能使用全血样本测定循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的功能应答。
　　全血流式细胞术样本制备步骤为：
　　抽血抗凝→稀释→生物素化的检测用单克隆抗体（单抗）→激动剂或缓冲液→固定（1%多聚甲醛）→FITC标记的鉴别用单抗→PE-卵白素→稀释。
　　稀释样本是为了防止血小板聚集，否则单个血小板上的抗原量就测不出来了，因为流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光，而不管这单个粒子是一个血小板还是几个血小板的聚集体。当用凝血酶作外源激动剂时，为防止血小板聚集并形成纤维蛋白凝块，可在全血标本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro （GPRP）［3］。固定这一步若不干扰单抗的结合，生物素化的检测用单抗也可以在固定后加入。血小板鉴别用单抗可在针对血小板特异性膜糖蛋白GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa的单抗中任选一种。标记这单抗的荧光试剂可在FITC、PE、PE-CY53种荧光染料中任选。
　　样本随后用流式细胞仪检测。通过荧光极性和特异性光散射鉴别出血小板后，检测5 000～10 000个血小板表面的特异性荧光讯号。检测结果可用两种方法表示。一种是平均颗粒荧光强度，另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。阳性血小板百分率法与荧光信号的放大倍数无关，且可以检测受损伤部位血小板亚群的变化。如果检测的是血小板表面某抗原的总量，则荧光强度法更为适合。譬如，在活化状态下，血小板表面GPIb-IX-V复合物含量比静息时低，但降低的幅度小，通常还不足以报告阴性结果［4］，这时用荧光强度法就比阳性血小板百分率法更合适。
　　目前传统的流式细胞术还不能定量分析结合位点的数目，但Shatti等［2］利用125I和生物素双标记的单抗进行研究，以PE-卵白素作为荧光结合试剂，发现碘标测定的结合位点数与荧光强度间有线性关系。因此，对于一个特定的单抗，一旦弄清这一线性关系，并知道荧光单抗上荧光素与抗体的摩尔比，就能利用流式细胞仪定量分析该抗体结合位点的数目。目前有一些商品试剂盒能定量测定结合到单个细胞上的抗体数目，但乏见用于血小板的报道。
　　2.优缺点：与常规血小板功能测定法比，全血法流式细胞术有许多优点。
　　首先，标本处理的简化能避免血小板体外医源性激活，并防止血小板亚群丢失；循环中的红细胞、白细胞对血小板的活化有影响，因此本法能在zui接近受检者体内环境的条件下测定血小板功能。同时，由于使用了血小板鉴别用单抗，检测的仅是血小板，而不会受其它种类细胞或碎片的干扰，保证了检测的特异性。其次，在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶体外活化血小板，也常表现为亚群激活；活化血小板表达CD62等膜糖蛋白也有明显的异质性［5］。本法能灵敏地检测出少到1%的活化血小板亚群［6］，尤其是能分析单个或亚群血小板膜上活化标志物的变化，使检测结果更接近真实。若同时使用FITC、PE、PE-CY5 3种荧光染料，本法通过三色标志一次能同时检测两个抗原标志物的变化。
　　此外，做一次检测仅需2 μl血液，这一点，尤其适合于新生儿和血小板减少性疾病患者。本法不使用同位素，没有放射性污染。　　全血法流式细胞术也存在不足之处。譬如，流式细胞仪价格高昂，检测费用高，仪器操作复杂。为了避免体外活化，血样需在45分钟内处理，不能久置。另外，流式细胞仪仅检测循环中的血小板功能，而β-TG、PF4和TXA2的检测还能反映血管壁上血小板的活化和新近被清除的血小板。虽然存在着这些不足，但本法仍是血小板功能检测的突破性进展。
　　二、全血中活化血小板的检测
　　1.血小板特异性膜糖蛋白：本法检测血小板功能，首先要对全血中的血小板进行特异性荧光标记，将血小板与血样中其他血细胞区分开来。针对血小板表面特异性膜糖蛋白制备的单抗，使血小板特异性标记成为可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究［7］，表1显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的几种［8］。根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板，仅给血小板做上荧光标记。
表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

膜糖蛋白	基因家族	配基	功能
GPⅠa/Ⅱa	整合素（B1）	胶原	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Fn	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Laminin	粘附
GPⅡb/Ⅲa	整合素（B3）	Fb,vWF,Vn,Fn	聚集
Vn受体	整合素（B3）	Vn,?vWF,?Fn	粘附
GPⅠb/Ⅸ	LRG	vWF，凝血酶	粘附
GPV	LRG	?	凝血酶底物
GPIV		Thrombospodin	粘附
GP53			血小板-粒细胞
GMP140	选择素		相互作用

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纤维蛋白原；Fn纤维粘连蛋白；Vn体外粘连蛋；LRG富含亮氨酸家族 　　2.活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。　　全血法流式细胞术也是一种免疫学方法，活化血小板表面能通过免疫方法检测的标志物可分为三类［9］：*类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）的PAC1表位［10］，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更地在更早阶段检测到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高［9］；GPIb-IX-V复合物（CD42）则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低［7］。它们都是活化血小板的分子标志。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。　　除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流［10］，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能［11］等。　　3.单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b等。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。